Le microscope à fluorescence est une sorte de microscope optique. Généralement, l'objet à observer est transparent ou la structure interne ne peut pas être bien distinguée par la couleur, alors le microscope à fluorescence est un bon choix pour résoudre le problème que le microscope ordinaire ne peut pas observer le matériau transparent. Le principe du microscope à fluorescence est d'utiliser une lumière de courte longueur d'onde pour irradier l'objet examiné qui a été coloré avec de la fluorescéine, de sorte qu'il sera excité pour produire une fluorescence de grande longueur d'onde, permettant ainsi à l'observateur d'observer la structure interne de l'échantillon. Dans un microscope à fluorescence, une longueur d'onde spécifique de la lumière d'excitation doit être sélectionnée à partir de l'éclairage de l'échantillon pour produire la fluorescence, puis la fluorescence doit être séparée de la lumière d'excitation et de fluorescence mélangée pour l'observation. Le système de filtrage joue donc un rôle extrêmement important dans la sélection d'une longueur d'onde spécifique. Les microscopes à fluorescence sont largement utilisés dans les domaines de la biologie et de la médecine.
Un microscope à fluorescence comprend les éléments de base suivants :
a. Source lumineuse : généralement des lampes à arc au xénon ou des lampes à mercure, mais ces dernières années, des LED à haute puissance ont également été utilisées.
b. Filtre (lumière incidente) : réduit la longueur d'onde de la lumière incidente pour ne laisser que la longueur d'onde utilisée pour exciter l'échantillon, ce qui est appelé de manière intéressante un filtre d'excitation.
c. Miroir ou réflecteur dichroïque : il réfléchit la lumière d'excitation sur l'échantillon et, en même temps, ne transmet au détecteur que la lumière émise par l'échantillon (comme illustré ci-dessous).
d. Filtre (émission) : ne laisse passer que la longueur d'onde de la lumière d'émission de l'échantillon et bloque toute lumière passant à travers le filtre d'excitation, qui, comme on peut s'y attendre, est appelé filtre d'émission.
e. Caméra CCD : la lumière émise ne sert à rien si elle ne peut pas être détectée ; pour l'imagerie de fluorescence, le détecteur est généralement une caméra CCD, qui est aussi généralement connectée à un écran d'ordinateur qui peut vous présenter une image.
Les miroirs dichroïques laissent passer les grandes longueurs d'onde de la lumière à travers le filtre tout en réfléchissant les petites longueurs d'onde de la lumière.
Classification de la microscopie à fluorescence :
Les microscopes à fluorescence sont généralement classés en deux catégories : les microscopes à transmission et les microscopes à retombées :
a. Transmissif : la lumière d'excitation provient du dessous de l'objet examiné, et la lentille de spotting est une lentille de spotting à champ sombre, de sorte que la lumière d'excitation ne pénètre pas dans l'objectif, mais que la fluorescence pénètre dans l'objectif. Il est brillant à faible grossissement, tandis que le grossissement élevé est sombre, dans l'immersion dans l'huile et le réglage, plus difficile à utiliser, en particulier à faible grossissement de la plage d'illumination est difficile à déterminer, mais peut obtenir un champ de vision très sombre de l'arrière-plan. Le type de transmission n'est pas utilisé pour les objets examinés non transparents.
b. Type à chute : le type à transmission est pratiquement éliminé à l'heure actuelle, le nouveau microscope à fluorescence est principalement de type à chute, la source lumineuse se trouve au sommet de l'objet examiné, et il y a un miroir de division du faisceau dans le chemin optique, de sorte qu'il convient à la fois aux objets examinés transparents et opaques. L'objectif jouant le rôle d'une lentille de mise au point, il est non seulement facile à utiliser, mais il permet également d'obtenir un éclairage uniforme de l'ensemble du champ d'observation, qu'il s'agisse d'un faible grossissement ou d'un fort grossissement.
Chemin optique typique d'un microscope à fluorescence à lumière tombante